正文
表观遗传修饰在糖尿病血管病变代谢记忆中的作用
谢林俊，郑运思，何华，柳晓泉*
（中国药科大学药物代谢动力学研究中心，江苏南京）
[摘要]糖尿病患者长期处于高血糖状态会对不同的组织器官造成损伤，即使恢复到正常血糖水平，这种损伤仍然持续存在。靶细胞记忆早期血糖环境的现象被称为“代谢记忆/高糖记忆”。代谢记忆的机制至今尚未明确，近来研究显示“代谢记忆”可能归因于靶细胞的表观遗传改变。通过从表观遗传的DNA甲基化、组蛋白转录后修饰、非编码miRNA调节这3个方面介绍糖尿病大血管、微血管病变的代谢记忆机制以及相应可能的治疗策略和方法，对于改善糖尿病代谢记忆导致的血管病变有一定的指导意义。
[关键词]表观遗传；糖尿病并发症；代谢记忆
早在年，糖尿病控制与并发症/糖尿病干预及并发症流行病学（DCCT/EDIC）研究组即提出了“代谢记忆”效应的概念。英国前瞻性糖尿病组织（UKPDS）的研究亦表明，2型糖尿病患者中，早期强化血糖治疗的获益在停止干预后仍然持续存在，10年后强化治疗组的糖尿病微血管并发症发生率持续降低，对大血管病变防治有一定的作用，心肌梗死率也明显降低。UKPDS和DCCT的后续研究均提示，糖尿病患者存在代谢记忆现象，早期强化血糖所带来的益处仍会持续多年，这就是血糖的代谢记忆效应。然而，最近发表的控制糖尿病患者心血管风险行动研究（ACCORD）结果显示，强化治疗组心血管事件的发生率没有明显降低，致死率却显著增加，最终终止了强化血糖治疗。而糖尿病治疗与心血管保护行动研究（ADVANCE）提示，强化降糖组微血管事件显著下降，而大血管事件无显著性下降。由此可见，控制血糖可显著减少微血管并发症的发生，但临床试验关于控制血糖能否减少大血管并发症结论不一致。机体对早期高血糖状态存在记忆的现象即为“代谢记忆”。随着对表观遗传学机制的不断探究和认识，很多学者认为表观遗传可能为“代谢记忆”的重要机制。
表观遗传是指核苷酸序列不发生变化的情况下，基因的表达活性发生了可遗传的变化，具有可遗传的特点。环境、饮食、药物等诸多因素均可引起基因的表观遗传学改变。高血糖环境可以通过激活调节DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和microRNA（miRNA）的表观遗传因子的信号通路来诱导表观遗传改变，从而使靶细胞中关键性基因的表达调控失调。这些表观遗传修饰变化的持续存在可能是代谢记忆产生的重要机制。
1DNA甲基化介导代谢记忆
1.1DNA甲基化介导微血管病变代谢记忆
在哺乳动物中，DNA的甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下以S-腺苷甲硫氨酸为供体，将甲基连到胞嘧啶（CpG）的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。CpG相对集中的区域称为CpG岛，其常位于转录调控区附近，CpG岛的甲基化和基因启动子区域的特有系列通过聚集转录抑制因子，最终抑制下游基因的转录。除此之外，DNA异常甲基化还会改变DNA和蛋白质之间的相互作用，导致基因沉默和蛋白表达变化。哺乳动物中，调控DNA甲基化的酶主要有DNMT、DNMT3a、DNMT3b这3种。脱甲基化过程一般通过脱甲基化酶（TET）家族介导。甲基化过程是动态的，DNA甲基化的同时伴随着DNA的脱甲基化过程，DNA甲基化异常修饰除了直接沉默基因表达外，还能够通过调控miRNA来间接影响机体的许多重要的生理病理过程。
糖尿病视网膜病变的进程中，线粒体动态平衡被打乱，线粒体DNA（mtDNA）功能受损，这些均加速了视网膜内皮细胞的凋亡及病变。最近研究表明，在大鼠模型中，糖尿病组线粒体中聚合酶γ1（POLG1）启动子及调节区CpG岛处于高甲基化状态，POLG调节区域CpG岛持续的高甲基化影响了POLG与mtDNA的结合，从而破坏转录活性，即使血糖水平恢复正常，DMNT活性在糖尿病和代谢记忆组中仍然显著增加，高甲基化状态得不到改善，该状态在体内模型中也持续存在，所以简单控制血糖不能逆转代谢记忆现象。mtDNA是环状DNA，缺乏组蛋白的包裹，故在高糖状态下极易接近活性氧簇（ROS），从而受到氧化损伤。在糖尿病视网膜病变中，视网膜mtDNA受到极大损伤，特别是mtDNA中有一段没有编码的序列D-环区（D-Loop），其含有很多DNA转录和复制所必需的调控元件，相对于mtDNA，其他区域更易受到损伤。受损的线粒体会释放更多的ROS，又引起更多的线粒体损伤，最终形成一个恶性循环。因此，这也更好地解释了代谢记忆现象对机体或者组织损伤是持续存在的。
线粒体转录因子A（TFAM）是mtDNA转录后修饰的关键性因子，可调节线粒体伴侣——热休克蛋白（HSP70）的表达水平。在病变视网膜内皮细胞中，TFAM发生泛素化，泛素化的TFAM可阻止HSP70转运至线粒体，导致mtDNA的转录低于正常水平，引起线粒体的功能障碍，即使血糖水平恢复正常，TFAM仍被泛素化修饰。
DNA错配修复（MMR）能调控线粒体的稳态，高糖环境下MMR受到了损害，D-Loop序列变异不能得到修复，同时POLG与之相关的酶在糖尿病患者视网膜及毛细管内皮细胞中处于异常状态，线粒体转录受到损害，在终止高糖状态之后线粒体功能障碍得不到改善，导致视网膜的障碍进程持续发生和发展，靶向线粒体的错配修复法则和相关的酶可以维持线粒体的稳态，减缓进程的进展。糖尿病状态下，视网膜细胞基质金属蛋白酶9（MMP-9）可增加细胞线粒体损害，最终诱导视网膜细胞的凋亡，在MMP-9的启动子区域，甲基转移酶DNMT1和脱甲基化酶Tet2之间处于动态平衡，这对MMP-9转录的激活起着重要的作用，提示调节MMP-9的甲基化状态对阻止线粒体的损伤，继而控制视网膜病变的进程和发展有一定的作用。
除了视网膜疾病之外，糖尿病肾病与DNA甲基化亦有关，编码硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）的基因持续的高甲基化的糖尿病患者更容易患有糖尿病肾病，实验结果表明，系统敲除大鼠TXNIP基因可以减少甲基化程度最终改善链脲霉素诱导的肾病。
1.2DNA甲基化介导大血管代谢记忆
在动脉粥样硬化的过程中，比如编码雌性激素受体在人类冠状动脉粥样硬化组织和升动脉斑块的区域处于低甲基化状态，衰老的内皮细胞和平滑肌细胞受体均显示低甲基化，提示对编码雌性激素受体的表观遗传修饰会影响血管衰老和动脉粥样硬化；在女性患者中沉默雌激素受体（ERs）的试验失败可能是由于雌性激素治疗没有同时起到心血管保护作用，说明在雌激素替代治疗后联合使用针对表观遗传修饰药物能更好地阻止心血管疾病进展。
Zebularing是一种胞嘧啶核苷类似物，这种类似物通过诱导胚胎干细胞（ESC）向心脏样细胞分化，通过抑制DNMT表达、刺激心脏特定基因的激活及诱导蛋白质的表达，最终起到改善心脏功能的作用。另外，在人体内，高同型半胱氨酸与一氧化氮、血管内皮生长因子（VEGF）和蛋白激酶（Akt）的下调相关，而且还与血管新生、平滑肌细胞的增殖、血脂异常、血管氧化应激和内皮再生的损害相关，这可能是由于同型半胱氨酸可诱导DNA甲基化水平降低，诱导某些基因的特定的启动子区域甲基化的发生有关。
2组蛋白修饰介导的代谢记忆
2.1组蛋白甲基化和乙酰化修饰介导微血管病变的代谢记忆
组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3、H4的精氨酸和赖氨酸残基上，由组蛋白甲基转移酶和脱甲基化酶调节。组蛋白乙酰化相关的酶包括组蛋白乙酰化酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC），前者可催化组蛋白乙酰化，导致染色质结构松散，促进基因转录，而后者可使组蛋白去乙酰化，导致染色质结构凝聚，抑制基因转录。一般情况下，转录活跃区的核小体组蛋白处于高乙酰化状态，而不活跃区呈低乙酰化状态，两者在组蛋白相同残基上的动态平衡通过HATs和HDACs的调节来实现。
研究显示，高糖环境下，增加SUVh2（H4K20三甲基化主要的酶之一）的蛋白质含量和基因的表达量，恢复血糖至正常水平，H3K20me3三甲基化水平仍持续增加，视网膜血管内皮细胞线粒体MnSOD的活性以及总的抗氧化物活性并未得到改善，这也导致了代谢记忆的发生。另有研究显示，糖尿病大鼠的视网膜内皮细胞中，高血糖增加了赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）和SOD2的结合，导致SOD2表达减弱，在恢复血糖之后这些分子所发挥的功能不能得到逆转，而基因沉默LSD1后可逆转该现象，这有望成为逆转高糖后肾病疾病进展的重要靶点。
另外，糖尿病患者中MMP-9处于激活状态，MMP-9会损害线粒体功能，诱导毛细管细胞的凋亡，进而引发病变。研究发现，糖尿病患者体内MMP-9启动子区域内H3K9me2降低，H3K9和核因子-κB（NF-κB）的亚基P65的相互作用增加，伴随着LSD1的活力增强和转运增加，沉默了LSD1，进而减少H3K9me2甲基化过程，最终抑制了MMP-9的激活，减少了线粒体的损伤和细胞的凋亡，提示调节LSD1对阻止糖尿病视网膜病变的发展有一定的作用。
动物研究显示，高糖能降低去乙酰化酶Sirtuin1（SIRT1）的活性并增加P65的乙酰化，从而活化MMP-9，造成线粒体损伤和细胞凋亡，除此之外，H2O2也会使SIRT1减少，造成MMP-9显著增加。衔接蛋白P66shc是代谢记忆机制中的关键因子，它在机体内的异常表达可直接导致一些代谢疾病。P66shc是线粒体的适配蛋白，细胞内的氧化还原环境的关键调节者；P66shc在动物机体内表达量的变化能对代谢记忆发挥重要作用。研究表明，乙酰转移酶GCN5和SIRT1对P66shc启动子的H3表观遗传修饰能引起P66shc表达上调；机体早期处于高糖环境时，细胞内环境蓄积的ROS反过来可以抑制SIRT1的去乙酰化水平，引起P66shc表达变化，从而导致持续的细胞凋亡现象和代谢记忆现象产生。P66shc的上调表达可致使人内皮细胞ROS的清除酶MnSOD的显著下降，导致血管内皮的ROS的蓄积，从而引起血管内皮的细胞炎症和细胞凋亡，最终导致代谢疾病。依赖P66shc产生的ROS致使PKCβII上调，从而抑制内皮型NO合酶（eNOS）在色氨酸位磷酸化，致使eNOS活性下降，NO含量下降，导致内皮功能障碍；ROS下游的Set7/9甲基转移酶对炎症和细胞凋亡具有重要调控作用，通过调控NF-κB亚基P65，使得下游单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）炎症基因上调，也会导致低级炎症反应，从而引发代谢性疾病。以上代谢记忆细胞间信号通路具体如图1所示。
硫氧还蛋白（TRX）是ROS的清除剂，与TRX相互作用蛋白（TXNIP）是TRX的内源性抑制剂，能促进高糖状态下氧化应激的发生。在视网膜内皮细胞中，高糖能促进组蛋白乙酰转移酶P与TXNIP的启动子结合，可促进组蛋白H4乙酰化；增加TXNIP的表达，即使血糖水平恢复到正常，TXNIP持续过表达现象仍没有改善。这提示TXNIP在表观遗传修饰和代谢记忆中起重要作用。
2.2组蛋白甲基化和乙酰化修饰介导的大血管病变代谢记忆
主动脉内皮细胞暴露于高糖状态，NF-κB启动子区域P65亚基会发生持续的组蛋白修饰，包括H3K4甲基化增加和H3K9甲基化降低，最终导致主动脉细胞持续的基因型改变。早期处于高糖状态时，大鼠主动脉细胞中会发生SetD7活性增加、H3K4me1升高、H3K9me2降低等组蛋白甲基化修饰的改变，最终导致eNOS和NADPH氧化酶（Nox4）持续高表达，诱导高血糖“代谢记忆”的形成。
3miRNA介导的代谢记忆
3.1miRNA介导的微血管病变代谢记忆
miRNA是一类高度保守的内源性非编码小RNA分子，由22~25个核苷酸组成。miRNA的主要功能是通过碱基配对结合于靶基因的mRNA3′端非编码区（UTR），使靶基因的mRNA降解或翻译受抑制，从而调节基因转录后的表达。
研究显示，核转录因子NF-κB的激活伴随着miR-a表达的增加，给予抗糖尿病药物治疗时能降低促炎因子对NF-κB的激活，导致miR-a的表达减少，但P65的启动子区域H3K4的单甲基化和H3K9的去甲基化表观修饰仍然存在，即使恢复到正常状态也不能逆转该现象。
研究证实，高血糖状态下miR-b和miR-a-5p能够调节核转录因子P65的持续表达，即使恢复到正常血糖水平，炎症的代谢记忆现象仍然存在。同样，在糖尿病视网膜疾病中，miR-家族的miR-b-3p可抑制腺苷脱氨酶2（ADA2）的表达，从而改善代谢记忆现象。高血糖和活性氧簇的激活可导致DNMT1的过表达，在恢复正常的血糖水平之后，miR-b升高反过来抑制了DNMT1的升高，降低了炎症基因（比如MCP-1和IL-6）的启动子区域H3K9甲基化，通过组蛋白修饰作用上调炎症基因的持续表达，诱导细胞高糖代谢记忆发生，致细胞损害持续存在。
研究显示，NF-κB在代谢记忆中的作用非常重要，长期的慢性炎症会促使SIRT1在细胞因子的启动子区域蓄积，进而诱导NF-κB的P65去乙酰化。高血糖可以通过增加正性转录因子Ac-NF-κB表达，进而促进miR-23b-3P的表达，而miR-23b-3P可下调SIRT1水平，从而增加Ac-NF-κB的表达，即使恢复到正常血糖的水平，代谢记忆现象还是存在，因此miR-23b-3P/SIRT1/NF-κB反馈通路可能成为改善改善糖尿病视网膜病变代谢记忆现象的主要机制之一。
3.2miRNA介导的大血管病变代谢记忆
研究显示，给予动脉粥样硬化患者miRNA拮抗剂Antagomir-92a治疗可以产生对内皮细胞功能障碍的保护作用，从而阻止动脉粥样硬化的发生。miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-和miR-的过表达能诱导人类心肌细胞肥大；同时miR-1和miR-的持续高表达会造成机体生理环境的紊乱，最终导致心肌肥大的发生，在体内和体外沉默miR-均会阻止心肌病的发生和发展。临床研究亦显示，抑制miR-表达对心肌肥大和心衰持续发生的代谢记忆现象有益。因此，miRNA抑制剂可能成为治疗心肌病的治疗策略。
4针对代谢记忆的可能治疗策略
糖尿病微血管并发症主要包括糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变。大量有关糖尿病及其并发症的临床研究表明，高血糖与糖尿病微血管并发症有显著相关性，调整其他危险因素后，糖化血红蛋白每增加1%则发生视网膜病变或肾衰竭危险性增加37%。因此，强化血糖控制对于糖尿病微血管病变的发生具有重要意义。早期强化控制血糖可逆转肾脏的高灌注、高滤过，减轻肾小球内的高压力，进而减少尿微量清蛋白的排泄率，延缓糖尿病肾病的进展。良好的血糖控制对于延缓糖尿病微血管并发症的发生和进展十分重要。三大临床数据（UKPDS、ACCORD、ADVANCE）普遍认为，控制血糖可显著性减少微血管并发症的发生，但是不能显著降低大血管并发症发病率，可能因为大血管病变的发病机制复杂，与血脂、血压、血尿酸等多种因素有关，因此，预防大血管病变的发生，患者不仅要严格控制血糖，还应同时控制血脂、血压等，另外也可能与受试人群年龄大，伴有心血管高危因素，糖尿病病程较长，不良代谢记忆效应也存在相关。糖尿病慢性血管并发症一经触发，即使强化控制血糖也已经无法阻止疾病的进展，并且激进的降糖措施必然导致血糖波动大，低血糖发生率高等不良事件。早期高血糖环境导致的表观遗传修饰变化的持续存在可能是大血管病变代谢记忆产生的机制，不像基因序列的变化是不可逆转的，表观遗传是可以逆转的。针对表观遗传机制的DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA这3个方面，糖尿病大血管并发症可能治疗策略介绍如下。
4.1DNA甲基化
多酚结构可能是潜在的DNMT抑制剂，可以调节很多靶点的表达。研究显示，在内皮细胞中，具有多酚结构的白藜芦醇可通过上调SIRT1的表达而改善代谢紊乱和炎症疾病。除了甲基化酶的作用，去甲基化酶在改善代谢记忆现象也起到一定的作用。通过斑马鱼模型研究显示，PARP抑制剂可阻止特殊位点的脱甲基化和Tet诱导产生的中间产物的蓄积，Tet在高血糖诱导的去甲基化中的作用可能是糖尿病代谢记忆的新机制，这也为代谢记忆治疗提供了一个新的视角。
4.2组蛋白甲基化和乙酰化修饰
小分子HDACs抑制剂能阻止心肌细胞的纤维化，在大血管并发症中发挥重要作用。在心肌梗死大鼠模型中，给予HDACs抑制剂PD-之后，发现PD-可通过抑制MMP-2和MMP-9的表达，使小鼠左房室重构降低，心肌功能增强。HDACs抑制剂对心衰患者有潜在的保护心肌作用。同时给予姜*素、组蛋白乙酰转移酶（CBP）/P抑制剂能阻止高血糖诱导的内皮功能障碍和心肌肥大，提示P可能成为逆转代谢记忆现象的靶点。另外，姜*素类似物C66可以降低在PAI-1等启动子区域的P/CBP的表达和H3K9/14乙酰化水平，提示C66可以改善代谢记忆现象。
C肽由胰岛素原裂解产生，一分子胰岛素原合成一分子C肽与一分子的A、B链，后二者合成胰岛素。最近研究表明，C肽能抑制内皮细胞和主动脉细胞的P53的持续上调和P66shc的激活、ROS的产生、氧化应激和内皮凋亡，因此C肽也可能成为治疗代谢记忆的策略。
二甲双胍是SIRT1的激动剂，在肝激酶B1（LKB1）/AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）/ROS通路中可削减高血糖诱导的内皮细胞凋亡，阻止代谢记忆的发生和发展；乙酰化酶和去乙酰化酶之间的平衡被打破是非组蛋白（例如p53）持续乙酰化和激活的原因。二甲双胍可导致SIRT1的过表达，激活或抑制线粒体ROS，上调LKB1/AMPK，激活PARP，诱导甘油醛-3-磷酸脱氢酶，最终抑制NF-κB和B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白（BAX）的表达；此外，二甲双胍治疗能降低氨氧化通路调节剂Nrf2的表达，同时抑制神经因子的转录，提示二甲双胍具有潜在的治疗代谢记忆的作用。
4.3miRNA
对于miRNA所致疾病的对应治疗方式较多。糖尿病大鼠模型研究显示，沉默miR-可以降低心肌病的发病率；高表达miR-能导致高血糖介导的心肌细胞的死亡，降低miR-以减少细胞的凋亡可改善代谢记忆。
因此，可以从表观遗传学的DNA甲基化、转录后蛋白质甲基化和乙酰化修饰以及miRNA等方面进行干预来治疗代谢记忆，比如组蛋白修饰酶和DNA甲基酶，特别是HDAC抑制剂、HAT抑制剂和HAT激活剂可能逆转代谢记忆。
5结语
糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，可以导致糖尿病特有的微血管并发症（视网膜病变、肾病、神经病变）和大血管并发症（心血管疾病和卒中）。若长期处于高血糖状态，即使后期血糖控制在较好的水平，糖尿病并发症仍然可能持续发生和发展。早期未控制血糖，在后期恢复到正常血糖水平不能降低心血管并发症的发生风险，其产生的严重后果成为重要的临床问题。“代谢记忆”可能是归因于表观遗传机制，表观遗传改变并不像基因序列的变化一样不可逆，这种改变是可逆的，因此可以从表观遗传学的DNA甲基化、转录后蛋白质修饰、miRNA调节异常等方面进行干预来逆转代谢记忆，阻止糖尿病并发症进程的发生和发展，降低糖尿病心血管病变发生的风险。
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